细胞培养基的渗透压检测

2017-11-14 17:53


细胞培养基作为生物制品生产的重要原材料之一,其质量对生物制品有重要的影响。细胞培养基的生产工艺和细胞培养基的原材料选用、生产过程及检验过程中的质量控制对于细胞培养基的产品质量具有直接影响。其中原材料的成份及其质量直接决定了细胞培养基产品的质量及安全性,选择合适的物料是实现细胞培养基功能过程中需要解决的基础问题。生产工艺的选择(如原料的研碎、混合技术等)及生产过程中的质量控制等直接影响产品的溶解性、批生产量及批次间差异,进而影响产品的质量。
而细胞培养基的检测项目为生物制品厂家控制原材料质量提供一定的依据,但是随着生物制品安全性要求的提高,其所检内容还有待完善,就目前的检测方法如下:

1. 澄清度检查法
该方法依据中国药典2010版二部附录IX B 澄清度检查法制定。澄清度是检查药品溶液的浑浊程度,即浊度,药品溶液中如存在细微颗粒,当直射光通过溶液时,可产生光散射和光吸收的现象,致使溶液微显浑浊,所以澄清度可在一定程度上反映药品的质量和生产工艺水平。水是培养基的溶剂,细胞培养基中的营养成份只有完全溶解于水才能被细胞吸收摄取,细胞才能生长增殖,因此培养基是否溶解以及培养液是否透明澄清直接影响培养基使用。通过对水溶解后的培养基的澄清度检查,判断细胞培养基的溶解性。此法是用规定级号的浊度标准溶液与供试品溶液比较,以判定细胞培养液的澄清度或其浑浊程度。

2. PH 值测定法
各种细胞的正常功能及一切生物化学反应,都是在适当和稳定的酸碱环境下进行的,因此细胞培养基的pH值是细胞生长的重要参数,pH值偏低或偏高都会影响细胞生长。该法依据中国药典2010年版二部附录Ⅵ H pH值的测定法进行。由于各酸度计的精度与操作方法有所不同,应严格按各仪器说明书与注意事项进行操作,并在使用之前注意校正。
在工业化使用时,由于传统的细胞培养基中含有pH指示剂如酚红等,通常依据“眼睛”观察培养液颜色来判定pH,或是简单的使用pH试纸测定,但是上述方法存在较大的主观因素,影响正确判定,并且在配制的过程中,不同区域还可能存在一定的水质区别等,采用pH仪器检测可以消除人的主观因素,准确性高。此外,在检测过程中,添加碳酸氢钠后的培养基在测定的过程中,暴露在空气中的时间也会对所测pH的准确性有一定的影响。

3. 干燥减量测定方法
细胞培养基具有吸湿性,在空气中放置时水份会很快升高,干燥减量表示产品中的含湿量。细胞培养基是有菌制剂,其丰富的营养成份有利于微生物生长,保持培养基中的低水份含量可以防止微生物的繁殖。检测细胞培养基中水份的含量采用的方法是干燥减量法。该测定方法是依据中国药典2010年版二部附录Ⅷ L 干燥失重测定法制定,具体是指产品在规定条件下干燥后所减失重量的百分率。减失的重量主要是水分、结晶水及其他挥发性物质等。由减失的重量和取样量计算供试品的干燥失重。

4. 渗透压
通常动物细胞必须生活在等渗环境中,借助K+、Na+维持渗透平衡。虽然大多数细胞对渗透压具有有一定的耐受性,但是培养液渗透压过高容易使细胞脱水萎缩,培养液渗透压过低容易使细胞膨胀破裂,控制培养基的渗透压范围对于细胞培养具有重要的作用。检测通常采用冰点渗透压仪进行,当供试品溶液的毫渗透压摩尔浓度太大或大于仪器的测定范围时,用适宜的溶剂稀释至可测定的毫渗透压摩尔浓度范围。

5. 细菌内毒素检测方法
细菌内毒素是许多病原性细菌所产生的毒素。细胞培养基中细菌内毒素过高,对生物制品的质量如纯度、引起副反应等方面有影响,而且会降低生物制品的产率。
细菌内毒素检查法通常利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素,以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。其检查包括凝胶法和光度测定法,后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时,可使用其中任何一种方法进行试验。通常当测的结果有争议时,以凝胶法结果为准。

6. 微生物限度
细胞培养基不是无菌产品,其中的微生物在一定条件下会吸收培养基中的营养物质滋生繁殖,导致培养基变质失效。控制细胞培养基中细菌和霉菌,是延长培养基有效期的方法之一,也是对生产企业的产品、原料、辅料、设备器具、工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生学评价的综合依据之一,对其的检测是非常必要的。检测方法依据中国药典2010年版附录Ⅺ J 微生物限度检查法进行,检查项目为细菌数、霉菌数。

7. 细胞生长试验
细胞在体外进行培养时,失去了机体的调节和控制作用,因此,细胞培养液除满足细胞的营养要求外,还必须使其生存环境接近活体的环境。其中培养液及外环境的培养条件如温度、渗透压、酸碱度等均能影响细胞的生长。细胞培养基的功能就是满足细胞体外生长增殖需求,因此细胞培养效果的检验是产品质量优劣的一个直观表述,是必检项目,这也是一个产品性能特性表述的要求。
细胞培养检测方法是:细胞在37℃恒温条件下,在含体积分数为3%~10%小牛血清的细胞培养液中生长72h,观察细胞形态并进行细胞计数;细胞生长72h后,更换不含小牛血清的细胞培养液,继续培养48h,观察细胞形态并进行细胞计数。培养过程中加血清培养主要检测培养基的培养质量,不加血清培养主要检测培养基的有无毒害物质。
细胞生长实验不但在使用一个新的产品时是必须进行的检测项目,在更换不同批次时,为检测是否有批间差也必须进行;此外,即使是同一个批次,分次购买时,或是存放搁置较长时间再次使用时,也需进行该项目检测,以防止培养基在贮存、运输过程中可能发生的质量变化。

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