高渗乳酸钠改善脓毒症大鼠模型的微循环、心功能和炎症

摘要

（1）背景：

高渗乳酸钠（HSL）可能在炎症过程中起作用。我们旨在评估其在大鼠实验性脓毒症（盲肠结扎穿刺（CLP））期间的作用。

（2）方法：

分三组（n=10/组）：假手术组、CLP-NaCl 0.9%和CLP-HSL（CLP后2.5ml/kg/h液体18小时）。评估肠系膜微循环、超声心动图、细胞因子和生化参数。对毛细血管渗漏（Evans blue，n=5/组）和心脏血流动力学（n=7/组）进行了另外两项实验。

（3）结果：

HSL改善了肠系膜微循环、心输出量和左心室短缩分数。HSL还提高了dP/dtmax斜率，降低了左室舒张末压-容积关系，并减少了肠道、肺和肝脏中的伊文思蓝扩散。乳酸和3-羟基丁酸在CLP-HSL中较高。HSL患者的血浆细胞因子（IL-1β，TNFα，IL-10）以及血浆VEGF-A减少。

（4）结论

高渗乳酸钠液可预防脓毒症时的心功能不全、肠系膜微循环改变和毛细血管渗漏，同时减少炎症并增强酮体。

Material and methods

前站、随机、对照的研究设计及伦理

动物程序

主要目的是比较HSL和0.9%NaCl对微循环的影响。基于先前的数据[21]，我们预先计算了每组10只雄性Sprague-Dawley大鼠（400-500g）的数量，足以确定微循环流量差异20%，α风险为5%，效能为90%。次要目标是心功能、毛细血管渗漏、炎症和代谢。由于与微循环研究不兼容，其中一些目标需要额外的动物。根据我们之前的经验，Evans blue和压力-容积回路分别为每组5只动物和7只动物。

实验流程

通过盲肠结扎穿刺（CLP）诱导脓毒症。通过腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪（75/5mg/kg）麻醉动物。将3-F聚氨酯灌注导管插入右颈静脉。结扎盲肠（占盲肠体积的75%）并刺穿盲肠（16克针头）以使粪便外部化。在手术结束时，将动物随机分为四组：接受11.2%乳酸钠的CLP-HSL（1000 mmol/L钠+1000 mmol/L乳酸钠，法国APHP），接受0.9%NaCl的CLP-NaCl（154 mmol/L氯+154 mmmol/L钠），接受8.4%碳酸氢钠的CLP-HSB（1000 mmmol/L碳酸氢钠+1000 mm/L钠），假手术采用宫颈切开术和剖腹术，但不使用导管/CLP。不幸的是，HSB组6只大鼠中只有2只存活。出于道德原因，并根据为本研究提供的合法授权，我们未完成本组研究。CLP大鼠无法获得水和食物，并接受了18小时内2.5毫升/千克/小时的研究液体输注。向CLP-NaCl溶液中添加8%的叔丁基葡萄糖，以产生与CLP-HSL组相同的热量[20]。实验中的大鼠被单独关在笼子里。在使用氯胺酮/甲苯噻嗪（75/5 mg/kg）麻醉后，实现了三组不同的实验：（1）超声心动图和激光斑点成像（n=10/组），（2）伊文思蓝测定（n=5/组），或（3）压力-容积回路（n=7/组）。

（1）超声心动图

在麻醉下实现超声心动图，并使用M模式测量左室舒张末期和收缩末期直径（LVEDD和LVESD），从而计算左室缩短分数（LVFS）。脉冲波多普勒用于采集和计算二尖瓣E/A比。通过近端肺动脉测量每克动物的心输出量。

（2）肠系膜灌注

超声心动图检查后，通过激光斑点对比成像对肠道进行微循环采集。在远离空肠部位的四个相似感兴趣区域实现图像分析，平均值表示为灌注单位（PU）。

（3）毛细血管渗漏和伊文思蓝测定

静脉注射伊文思蓝，45分钟后用多聚甲醛将其从血流中冲洗掉。心脏（左心室）、肺、肠道和肝脏样品在60°C下脱水5天，然后在37°C下在10%甲酰胺中孵育3天。使用分光光度法在620nm处测量离心上清液的吸光度。

在CLP-NaCl和CLP-HSL组中记录液体平衡（尿量和输注液体之间的差异）。

（4）血流动力学

获得左心室（LV）的压力-容积环和血流动力学。记录/计算左室收缩压（LVESP）、左室舒张压（LVEDP）、dP/dtmin、dP/dtmax和左室舒张常数tau（Weiss法）。计算LVESP和LVEDP关系（LVESPVR和LVEDPVR），作为负荷无关的左室收缩功能和左室顺应性的指标。在程序结束时采集血样，使用冷冻渗透压计测量和比较血浆渗透压（mosmol/kg）。

（5）生物学参数

在手术结束时，采集最大体积的血液。

（6）炎症和毛细血管渗漏相关标志物

IL-1β、TNFα和IL-10；使用ELISA测定血管内皮生长因子A型（VEGF-A）和syndecan-1。

（7）生物化学

　　在血液和尿液中测量尿素、钠、钾和氯化物。在血液中测量白蛋白。计算实验期间排出的离子的绝对量，计算整个实验期间注入的离子量和排出的离子量之间的差异，并反映出在输注期间体内过量的离子。

（8）新陈代谢

测定血糖、乳酸、丙酮酸、3-羟基丁酸和乙酰乙酸的血含量。

（9）统计分析

使用达戈斯蒂诺检验评估数据分布，数据以四分位间距[IQ1–IQ3]或标准偏差（±SD）的均值表示。根据分布的正态性，使用非参数检验（Kruskal Wallis或Mann-Whitney）或参数检验（ANOVA或t-Student）实现组间比较，如果结果显著，则使用Dunn或Holm-Sidak的多重比较检验进行事后分析。实现了两个比较：CLP-NaCl组与假手术组和CLP-NaCl组与CLP-HSL组。因为我们旨在评估HSL在脓毒症期间的作用，所以sham和CLP-HSL之间的比较并不相关，可能会降低分析的能力。所有比较均使用Prism v8.0（美国GraphPad）实现。p<0.05被认为是显著的。如果缺少关于每组实验次要终点的数据，则应用对照组的中值来支持无效假设。

结果

在每组22只大鼠中（3组实验），CLP-HSL组2只和CLP-NaCl组1只在灌注结束前死亡（补充新大鼠）。

（1）肠系膜灌注

与假手术组相比，CLP-NaCl组的肠系膜灌注平均值显著降低（286±129对957±169 PU，p<0.0001）。相反，与氯化钠相比，HSL显著增强了CLP大鼠的灌注（712±366对286±129 PU，p=0.0006，图1）。

图1. 激光散斑成像评价肠系膜微循环

（2）毛细血管渗漏

与假手术组相比，CLP-NaCL组的肺（300[253-452]vs.149[83-152]，p=0.04），肠道（113[88-189]vs.35[21-41]，p=O.009）和肝脏（70[50-89]vs.18[15-26]，p=o.02）的伊文思蓝扩散增加（图2）。心脏没有观察到差异。相反，在CLP大鼠中，与NaCl相比，HSL导致肺（94[78-136]vs.300[253-452]，p=0.006）、肠道（37[31-43]vs.113[88-189]，p=0.03）和肝脏（24[14-37]vs.70[50-89]，p=0.04）的伊文思蓝扩散减少，但心脏没有。同样，HSL与NaCl相比显著改善了流体平衡(− 1.5 [− 1.7至− 0.7]vs.2.0[1.6–2.2]mL/kg/h，p=0.002），HSL大鼠的尿量显著较高（3.9[3.2–4.1]vs.0.3[0.3–0.8]mL/千克/h，p=0.008）（两组的输液量均为2.5 mL/kg/h，如“材料和方法”一节所述）。

图2. 在肺（a）、肠（b）、肝（b）和心脏（d）中使用伊文思蓝测定法（n=5/组）检测毛细血管渗漏。液体平衡结果（e）、尿量和输注液体结果（f）

（3）超声心动图

与假手术组相比，CLP-NaCl组的心脏输出量减少（0.14[0.01-0.18]对0.30[0.26-0.34]mL/min/g，p=0.004），尽管左室短缩分数没有差异（39[33-52]对44[41-47]。关于我们模型中可用的前负荷静态指标，CLP-NaCl组与假手术组相比LVEDD降低（6.2[5.2–7.3]vs.9.4[8.8–9.6]mm，p=0.001），但在E/A二尖瓣血流比方面没有观察到差异（1.3±0.4 vs.1.7±0.5，p=1.2）。

HSL vs.NaCl显著改善了高心排血量（0.34[0.28–0.43]vs.0.14[0.01–0.18]mL/min/g，p<0.0001）和短缩分数（55[46–73]vs.39[33–52]%，p=0.009）的CLP大鼠的左室收缩功能。未观察到与预负荷静态指数相关的差异。

图3 经胸超声心动图

（4）LV pressure-volume loops

与假手术相比，CLP-NaCl组平均动脉压、舒张动脉压、系统动脉压和脉搏动脉压降低。压力描记显示，由于心室向力性降低，dP/dtmax和LVESP降低。然而，LVESPVR无差异，表明向力性的改变可能与心脏前负荷和/或后负荷的改变有关。相反，在CLP-NaCl大鼠中，dP/dtmin和LVEDPVR发生了改变，表明心室顺应性的改变，与心脏前负荷无关。与NaCl相比，给予HSL不会导致不同水平的动脉血压，但dP/dtmax更高，LVESPVR无差异，这表明向力性有所改善，但可能与前负荷增加有关。LVEDPVR的降低表明心室顺应性的改善依赖于心脏前负荷/后负荷。在本实验中，CLP-NaCl与假手术大鼠之间以及CLP-NaCl与CLP-HSL大鼠之间的血浆渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）没有变化（表1）。

表1：有创血流动力学参数和压力-容积回路（n=7/组）

（5）生物学参数

结果如表2所示。在CLP大鼠中，输注HSL与血浆钠浓度和尿钠排泄显著升高相关，而血浆氯和钾降低。ΔNa+，代表输注期间体内钠的累积，在CLP-HSL和CLP-NaCl组之间没有显著差异。与假手术组相比，CLP-NaCl中的尿素含量是假手术组的两倍，而HSL导致较低的血浆水平。与假手术组相比，CLP-NaCl组白蛋白减少，但与CLP-HSL组相比没有。

关于代谢，CLP-NaCl组与假手术组相比，血糖降低了两倍，血浆3-羟基丁酸减少。相反，与NaCl相比，HSL与较高的血糖、乳酸、丙酮酸和3-羟基丁酸的血浆水平相关，但两组之间乳酸/丙酮酸比率没有差异。

（6）炎症

与假手术组相比，CLP-NaCl组炎症反应增强，细胞因子IL-1β、TNFα和IL-10显著升高（图4，表2）。与NaCl相比，HSL降低了血浆中IL-1β、TNFα和IL-10的水平。

假手术组、CLP-NaCl组和CLP-HSL组之间的VEGF-A或syndecan-1无差异，但CLP-NaCl组与CLP-HSL组之间的VEGF-A水平降低。

总结：总之，在实验性脓毒症模型中使用高渗乳酸液体可以改善微循环、毛细血管渗漏以及心脏和肾脏功能，可能通过代谢和炎症途径实现。实验和临床研究都有必要深化HSL改善脓毒症的机制，以及可能转移到临床脓毒症的治疗上。