渗透压对CHO细胞生长、细胞体积、抗体产率及糖基化的影响

1、介绍

中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的培养渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）和细胞体积与特定的重组蛋白生产力相关，生物合成能力和营养交换取决于细胞大小，而细胞大小又受到培养物渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）的影响，已知高渗条件会导致细胞体积增加。

细胞大小是特定蛋白质生产力的决定因素。尽管每个细胞周期阶段的细胞都具有生产力，但G2/M期的细胞表现出最高的生产力。
在某些研究中，滴度的增加伴随着蛋白质质量的变化，特别是在糖基化方面，已经发现高渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）可以降低Fc融合蛋白的N-糖中酸性异构体和唾液酸含量的比例，这可以通过添加甜菜碱来避免。
同样，在补料分批培养阶段，渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）浓度增加60-120mOsm/kg会导致未充分加工的聚糖的分泌。

2、结果和讨论

一、高渗透压对细胞生长和代谢的影响

图1：中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的最大生长速率与细胞外渗透压的函数关系。

我们在接种前向培养基中加入NaCl或补料C，以获得320至500 mOsm kg−1之间的初始渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）值。如图1所示，在这两种情况下，渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）的增加导致最大特定细胞生长率显著降低。两种处理方式的最大生长率差异无统计学意义（p>0.05）。

不同渗透压条件下细胞培养参数随时间的变化曲线

活细胞密度曲线如图2A所示随着盐或补料的添加渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）浓度增加，生长速率明显降低。这些发现表明，添加补料会严重抑制细胞生长，在（添加补料C）渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）达到500 mOsm kg−1的情况下可以清楚地看到这一点。在培养过程中，渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）值增加（图2B），主要是由于细胞外乳酸、Na+和K+的积累（图2，分别为E、G和H）。

直到第5天，平均细胞直径与渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）呈正相关（图2C），其值在接种后24小时快速增加，特别是对于添加补料C超过410 mOsm kg−1与对照组相比非常明显。然而，从第6天开始，当对照和添加NaCl的培养物中的葡萄糖和谷氨酸等关键营养物质开始耗尽时，趋势发生了变化（图2F、2I）。

氨浓度(图2D)呈逐渐增加的趋势，但只有3种条件超过5mM，对该细胞系[36]有明显的抑制作用。然而，在所有情况下，这一阈值是在静止期或后期培养，很可能不损害达到高峰细胞密度。图2E，F分别显示细胞外乳酸菌和葡萄糖的分布，其中前者从产生到消耗的转变仅在对照和320mOsmkg-1条件下进行。其余的培养物在整个培养过程中表现出持续的乳酸产生，在一些添加NaCl的培养物中，乳酸似乎来自葡萄糖以外的其他来源。从乳酸产生到消耗的转变被认为取决于培养液的pH值。

图3 不同渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）条件下（A）氨、（B）葡萄糖、（c）谷氨酸、（D）谷氨酰胺和（E）乳酸的特定摄取/产生速率。对照培养物未产生可检测水平的谷氨酰胺。误差条表示两个平行实验的标准偏差。对于显著性分析（*p<0.05），假设不同实验之间每个变量的方差相等.

图3显示了指数生长阶段（即根据第0天至第6天的数据计算）我们观察到了恒定的渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）值。与对照组相比，所有培养物的特定葡萄糖消耗率都较高，尽管表现出较低的特定细胞生长率。无论随后的高渗处理如何，随着渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）的增加，葡萄糖上的乳酸产量都更高，这表明无论诱导方法如何，碳代谢都不充分。先前已经报道，在较高的残留葡萄糖浓度下，葡萄糖上的乳酸产量增加。事实上，我们的实验结果指向相同的表型。比较使用相同诱导方法的培养物之间的残留葡萄糖浓度（图2F），我们发现葡萄糖浓度越高，在细胞生长期（两天的初始适应期，随后是指数细胞生长）内乳酸的产生率就越高（图3E）。这种行为在培养后期仍在继续，在正常渗透压条件下（对照和370mOsm kg−1 NaCl）的两种培养物显示出乳酸浓度的快速下降，这是由于细胞将代谢产物作为碳源重新内化所致（图2E）。在加入NaCl的最高渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）培养物的情况下，产生的乳酸盐的一部分似乎来自糖酵解以外的来源。先前有报道称，谷氨酸解酶可以在癌症细胞中提供碳和氮，已知这些细胞与CHO细胞具有相似的代谢特征。有趣的是，当渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）值在410-420mOsm kg−1范围内时，在两种高渗诱导策略下，氨的产生率没有显著差异。然而，这种变化在460–470 mOsm kg−1范围内，其中NaCl培养物表现出显著更高的氨生成率（p<0.05）。具体而言，添加NaCl的培养物比添加补料C的实验分泌更多的氨（图3A）。这与各自的谷氨酰胺生产速率一致，后者使用氨合成和分泌谷氨酰胺的速率高于前者（图3D）。然而，谷氨酸的摄取/生产速率并不遵循相同的模式，460–470 mOsm kg−1范围内的NaCl培养物消耗谷氨酸，而补料C培养物分泌谷氨酸。鉴于补料C富含氨基酸，我们假设这些培养物将其他氨基酸转化为谷氨酸，然后用于合成谷氨酰胺。有趣的是，500 mOsm kg−1的培养物表现不同，表现出氨和谷氨酸产量增加，谷氨酰胺分泌减少，表明在这些高渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）、营养丰富的条件下有不同的代谢途径。

二、高渗压对滴度和特异性抗体生产率及糖基化的影响

图4显示了所有培养物收获时的mAb滴度和各自的整体活细胞密度（IVCD）值。最高滴度为410 mOsm kg−1，添加补料C也显示出最高的IVCD，尽管后者与对照培养物没有显著差异。在另一端，500 mOsm kg−1补料C培养物的IVCD和mAb滴度最低。总的来说，滴度大致遵循与IVCD相同的趋势，470 mOsm kg−1 NaCl培养物除外。从图5中的特定mAb生产力我们可以看到，在所有条件下，470 mOsm kg−1 NaCl培养物的mAb分泌率最高。这不仅高于对照培养物，而且明显高于所有添加补料C培养物。有趣的是，补充NaCl的培养物显示出特定mAb生产力的增加，这与渗透压值呈正相关，而添加补料C的培养物在三种不同的渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）值之间没有统计学上的显著差异。这可能源于后一种培养物由于葡萄糖丰度高，对营养物质的利用效率较低。此外，470 mOsm kg−1 NaCl和410 mOsm kg−1补料C培养物在第6天后表现出明显更大的细胞直径，如图2C所示。

两种高渗诱导方法对收获时mAb糖基化的影响如图6所示。在添加NaCl的培养物中，聚糖分布没有统计学上的显著差异（p>0.05）。然而，添加更多补料C的培养物显示，随着渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）的增加，G0F下降（410和500 mOsm kg−1之间的差异为18%）。这伴随着G0的增加（410和500 mOsm kg−1之间的差异为10%）和半乳糖基化百分比的较小增加（G1F、G10F和G2F）。然而，毫不奇怪，表现出最高物种生产力（410 mOsm kg−1补料c）的培养物也显示出非半乳糖基化的百分比增加。另一方面，抗体合成和分泌的高速率可能限制了抗体在高尔基体中的停留时间，因此降低了负责mAb半乳糖基化的b-1,4-半乳糖基转移酶（b4GalT）对聚糖的进一步加工程度。与预期的非半乳糖基化结构的分布增加相反，核心岩藻糖基化在培养物中表现出意想不到的行为，包括添加补料C以调节渗透压。如图6所示，最高渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）条件（500 mOsm kg−1补料C）的核心岩藻糖基化水平明显低于410 mOsm kg−1补料C样品（p<0.05），尽管其特异性抗体生产率较低。上述观察结果可能表明，由于较高的渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）水平，a-1,6-岩藻糖基转移酶（FucT）酶活性受到抑制或基因（Fut8）表达减少，假设核心岩藻糖化的共底物GDP岩藻糖的水平不受渗透压变化的影响。

三、高渗透压对细胞体积的影响

在研究了CHO细胞培养开始时添加补料和盐诱导的高渗性的影响后，我们在生物反应器中观察了一组典型的补料CHO细胞。后者更好地代表了典型的生产条件，在这种条件下，由于营养物质的补充和代谢物的产生，细胞外渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）比初始值增加了70%，此前有报道称，这会导致细胞体积增加四倍。此外，在生物反应器环境中，我们可以有效地控制培养物的pH，但也可以探索在指数生长期间将温度转移到温和低温条件的影响，这是延长培养时间和提高产品滴度的常用策略。在我们的生物反应器研究中，代谢在36.5℃时更活跃、 其中葡萄糖和乳酸两者比在亚低温下更容易被消耗。这导致渗透压摩尔浓度在36.5时缓慢增加，用于相同的补料计划（图7a）。将平均细胞大小绘制为渗透压浓度的函数，说明了渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）浓度对细胞体积的影响（图7b）。

结果

在CHO细胞的Fed-Batch培养模式下，补料的添加和代谢产物的积累导致后期培养液物中细胞外渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）的增加。
通过NaCl调节渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）至470 mOsm/kg时对抗体产率和滴度具有促进作用，但是通过补加Feed C提高了mAb产率，但细胞生长速率显著降低且导致半乳糖基化水平比例显著降低。

3、结论

在本研究中，我们检测了高渗条件对CHO细胞生长、细胞体积和抗体产生的影响。我们比较了两种诱导高渗性的方法，添加NaCl和添加补料C。渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）对细胞生长和抗体滴度的影响程度差异很大，取决于渗透压的值以及增加渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）的方法。这是因为，尽管高渗条件在所有条件下都提高了特定抗体的生产力，但它们也对生长产生了不利影响，这意味着在某些情况下总滴度低于对照。令人惊讶的是，与补充补料C的培养物相比，补充NaCl的培养物表现出更一致的行为，这表明过量营养物添加对生长速率的不利影响。